استفاده از آنزیم طبیعی لیزوزیم به عنوان نگهدارنده در پنیر

ایمنی موادغذایی یکی از مهم‌ترین چالش‌های صنایع غذایی است. از آنجاییکه وجود نگهدارنده‎‌های مصنوعی در چند سال اخیر باعث نگرانی مصرف‌کنندگان شده است، محققان و تولیدکنندگان مواد غذایی اخیرا تحقیقات گسترده‌ای در مورد استفاده محدود از نگهدارنده‌های مصنوعی و جایگزینی استفاده از نگهدارنده‌های طبیعی مانند عصاره‌ها و اسانس‌های گیاهی، باکتریوسین‌های ضد میکروبی انجام داده‌اند.

ساختار، نوع و خواص لیزوزیم

آنزیم طبیعی لیزوزیم، که توانایی ضد میکروبی هم دارد و به طور بالقوه در صنایع مختلف استفاده می‌شود. چرا که لیزوزیم خاصیت سمی کمی دارد و جزیی از سیستم ایمنی انسان است و می‌تواند یک عامل ضد میکروبی طبیعی در صنعت غذا محسوب شود. لیزوزوم‌ها براساس تفاوت در توالی اسیدهای آمینه و خواص ساختاری، به سه نوع c، ،g و i طبقه‌بندی می‌شوند. این آنزیم با هیدرولیز پیوندهای 1، 4 بتا بین ان-استیل مورامیک و ان-استیل گلوکوزآمین در دیواره‌ی سلولی، فعالیت ضد میکروبی را علیه میکروارگانیسم‌ها، به ویژه باکتری‌های گرم مثبت اعمال می‌کند. همچنین از طریق فعل و انفعالات شیمیایی یا فیزیکی در جهت اصلاح لیزوزیم ، می‌توان این فعالیت ضد میکروبی لیزوزیم را در برابر باکتری‌های گرم منفی نیز ایجاد کرد. عوامل زیادی در آلودگی پنیر نقش دارند، که از جمله می‌توان به آلودگی باکتری‌ها و قارچ‌ها، فرآیندهای کنترل نشده و نامناسب، و همچنین آلودگی پس از پاستوریزاسیون اشاره کرد. در نتیجه، لیزوزیم به عنوان یک عامل نگهدارنده (نگهدارنده زیستی) در تولید پنیر، می‌تواند به تنهایی یا در ترکیب با سایر نگهدارنده‌ها استفاده شود.

لیزوزیم با نام‌های مورامیداز یا N-استیل مورامیک هیدرولاز نیز شناخته می‌شود. این آنزیم کوچک و مونومری توسط الکساندر فلمینگ به طور تصادفی کشف شد، به طوریکه یک قطره از مخاط بینی او باعث هیدرولیز باکتری شد. لیزوزیم به مقدار زیادی در اشک، بزاق، سرم خون، شیر انسان و گاو، سفیده تخم پرندگان و تقریبا در اکثر باکتری‌ها و باکتریوفاژها وجود دارد. سفیده تخم‌مرغ قابل دسترس‌ترین منبع لیزوزیم است که به طور کلی به عنوان یک نگهدارنده در محصولات مختلف مانند میوه‌ها و سبزیجات، گوشت، شیر و محصولات لبنی قابل استفاده است.

از جمله مهم‌ترین عوامل آلودگی پاتوژن‌های غذایی موجود در پنیر، می‌توان به لیستریا مونوسیتوژنز، سالمونلا، اشرشیاکلی، استافیلوکوکوس اورئوس، و باسیلوس سرئوس اشاره کرد. از دیگر ویژگی لیزوزیم مقاومت به حرارت این آنزیم است که به دلیل وجود شش ناحیه مارپیچ و پیوندهای دی‌سولفیدی می‌باشد.

فعالیت ضد میکروبی لیزوزیم

تمامی این آنزیم‌ها توانایی هیدرولیز پیوندهای گلیکوزیدی بتا (4-1) بین پپتیدوگلیکان را دارند. به این صورت که دیواره سلولی باکتری‌های گرم مثبت شامل لایه‌های پپتیدوگلیکان (حدود 40 لایه) و بدون هیچ غشای خارجی می‌باشد که پلی‌ساکاریدها، اسیدهای لیپوتیکوئیک و تیکوئیک به پپتیدوگلیکان متصل هستند. بنابراین آن‌ها مستعد حمله لیزوزیم هستند. سطح اسیدهای تیکوئیک در دیواره سلولی باکتری‌های گرم مثبت می‌تواند بر میزان حساسیت آن‌ها به لیزوزیم تاثیر بگذارد، چرا که این اسیدها با بار منفی، قادر به اتصال به لیزوزیم هستند و فعالیت آن را کاهش می‌دهند.

عوامل متعددی بر پایداری فعالیت ضد میکروبی لیزوزیم در مواد غذایی موثر است، از جمله pH، دما، غلظت نمک، و فشار اسمزی. بیشترین میزان فعالیت آنزیمی و تغییرات ساختار لیزوزیم درpH=5  و میزان ثبات و فعالیت کم‌تری در 3.8 pH< مشاهده شده است.

براساس اطلاعات به دست آمده در مورد حساسیت به لیزوزیم در باکتری‌های مربوط به مواد غذایی، برخی از باکتری‌های گرم مثبت مانند میکروکوکوس، سارسینا، کلستریدیوم تیروبوتیریکوم، کلستریدیوم ترموساکارولیتیکوم، باسیلوس استئاروترموفیلوس، و باسیلوس کواگولانس به شدت توسط آنزیم لیزوزوم موجود در سفیده تخم‌مرغ، مورد حمله قرار گرفتند.

از طرف دیگر، لیزوزوم در برابر باکتری‌های گرم منفی بی‌اثر می‌باشد، زیرا دارای لایه نازکی از پپتیدوگلیکان بدون اسیدهای تیکوئیک هستند و همینطور با غشای خارجی حاوی فسفولیپیدها، لیپو‌پروتئین‌ها، و لیپوساکاریدها پوشانده شده‌اند که این غشای خارجی به عنوان یک سد عمل کرده و دسترسی لیزوزیم به زنجیره پپتیدوگلیکان را محدود می‌کند. با این حال، این مانع می‌تواند به وسیله عوامل نفوذپذیر غشایی، مثل کاروکرول، اسیدهای ‌آلی، لاکتوفرین، و اتیلن‌دی‌آمین تتراستیک اسید (EDTA) یا کونژوگاسیون لیزوزیم به کربوهیدرات‌ها، دناتوره شدن لیزوزیم و از طریق پیوند با سایر ترکیبات (پلی‌ساکاریدها، پپتیدهای آبگریز، و اسیدهای چرب) مختل شود. در مطالعات انجام شده گزارش شده است که اعمال فشار هیدرواستاتیک بالا و میدان الکتریکی پالسی می‌تواند حساسیت باکتری‌های گرم منفی مانند اشرشیاکلی را به لیزوزیم افزایش دهد.

علاوه بر آن فعالیت آنزیمی لیزوزیم به عنوان یک عمل‌کننده آنتی‌باکتری، دارای فعالیت هیدرولیزکننده باکتری‌های مربوط به ویژگی‌های آبگریز، ساختاری و کاتیونی آن‌ها است. این آنزیم به عنوان یک پروتئین کاتیونی می‌تواند از طریق برهمکنش‌های الکترواستاتیکی بین اجزای غشای باکتری (فسفولیپیدها) و پروتئین، منافذی را در غشای باکتری ایجاد کرده و در نتیجه موجب نشت غشا بدون هیدرولیز پپتیدوگلیکان شود. لیزوزیم همچنین فعالیت ضعیفی در برابر مخمر دارد، زیرا مانوپروتئین و بتاگلوکان‌های فیبری (3-1) از ترکیبات اصلی دیواره سلولی مخمر هستند، اما فعالیت کیتیناز لیزوزیم خیلی قوی نیست.

آنزیم لیزوزیم همچنین می‌تواند از رشد ویروس‌ها و قارچ‌هایی مانند آسپرژیلوس نایجر و پنیسیلیوم را مهار کند. این آنزیم با تشکیل کمپلکس‌هایی با DNA ویروس‌ها، فعالیت ضد ویروسی از خود نشان داده است.

کاربرد لیزوزیم در پنیر

در صنایع لبنی، لیزوزیم را می‌توان در تولید پنیر به کار برد تا از رشد باکتری‌های عامل فساد که عامل ایجاد بادکردگی، طعم‌های ناخوشاید در محصول نهایی و آسیب به بافت هستند، جلوگیری کند.

براساس آزمایش‌های انجام شده، لیزوزیم بومی ترکیب شده با دکستران، در سطح 400 میکروگرم بر میلی‌لیتر و آنزیم گیلیکوزیله در کاهش اشرشیاکلی تاثیر چشم‌گیری داشت. از طرف دیگر، لیزوزیم به راحتی به دلیل مواد آبگریز، مانند لیپوساکارید مرتبط با لایه نازک پپتیدوگلیکان باکتری‌های گرم منفی، نمی‌تواند به دیواره سلولی باکتری‌های گرم منفی نفوذ کرده و آن‌ها را هیدرولیز کند.

آنزیم لیزوزیم و نمک دی‌سدیم‌اتیلن‌دی‌آمین‌تترا استیک‌اسید (Na₂-EDTA) می‌توانند در جلوگیری از رشد کلی‌فرم‌ها و سودوموناس در طی ۷ روز نگهداری موثر باشند. همچنین گزارش شده است که میکروبیوتای عملکرد پنیر موزارلا مانند باکتری‌های اسید لاکتیک به هیچ وجه تحت تاثیر افزودن این ترکیبات فعال، قرار نگرفت و درنتیجه می‌توان گفت که استفاده از لیزوزیم و نمک دی‌سدیم‌ اتیلن‌دی‌آمین ‌تترا استیک اسید در شرایط آب نمک، عمر ماندگاری پنیر موزارلا را افزایش می‌دهد.

در نتیجه لیزوزیم یا نمک‌دی‌سدیم ‌اتیلن‌دی‌آمین‌ تترا استیک اسید (Na₂-EDTA) در ترکیب با مونو‌آمونیوم‌فسفات (MAP)، به ویژه در بالاترین غلظت لیزوزیم (500 میلی‌گرم بر کیلوگرم) می‌تواند به عنوان یک استراتژی موثر در برابر میکروارگانیسم‌های عامل فساد در نظر گرفته شود. فعالیت ضد میکروبی لیزوزیم که از رشد باکتری‌ها، به ویژه باکتری‌های سرمادوست که مسئول لیپولیز و پروتئولیز پنیر در طول دوره‌ی نگهداری هستند، جلوگیری می‌کند را می‌توان به توانایی آن در تخریب ساختار باکتری‌ها و قارچ‌های دیواره سلولی نسبت داد.

علاوه بر استفاده مستقیم از آنزیم لیزوزیم در پنیر یا آب نمک آن، کاربرد لیزوزیم به عنوان یک عامل ضد میکروبی در بسته‌بندی مثل پوشش و فیلم نیز مورد بررسی قرار گرفته است که مشاهده شد که لایه‌ها و پوشش‌های کامپوزیتی متشکل از کیتوزان‌لیزوزیم رشد لیستریا مونوسیتوژنز، سودوموناس فلورسنس، اشرشیاکلای، و کپک در پنیر موزارلا را به نسبت لایه‌ها و پوشش‌های چند لایه به طور چشمگیری کاهش داد.بنابراین، خواص ضد میکروبی لیزوزیم برای باکتری‌های گرم منفی نیز می‌تواند استفاده شود.

آیا مصرف لیزوزیم برای سلامتی ضرر دارد؟

یکی از موضوعات بحث برانگیز در مورد لیزوزیم، نقش آن به عنوان آلرژن است. برخی از مطالعات نشان دادند که لیزوزیم به عنوان یک آلرژن ضعیف عمل می‌کند. سفیده تخم‌مرغ برای افراد حساس به ویژه کودکان، حساسیت‌زا محسوب می‌شود و این حساسیت مربوط به پروتئین‌هایی مانند کونالبومین، اووموکوئید، اوآلبومین، و لیزوزیم است، که در این بین واکنش‌های آلرژیک مریوط به لیزوزیم کمتر از سایر پروتئین‌های سفیده تخم‌مرغ است. از آنجایی که پس از مصرف پنیر حاوی لیزوزیم، در افراد حساس به تخم‌مرغ با یا بدون حساسیت به لیزوزیم، هیچ عارضه جانبی و پاسخ‌های ایمنی شناسایی نشده، این احتمال وجود دارد که استفاده از لیزوزیم در سطوح مجاز در مواد غذایی نمی‌تواند به عنوان یک نگرانی بهداشتی در نظر گرفته شود. لیزوزیم توسط سازمان غذا و داروی ایالات متحده (FDA) برای استفاده در پنیر، ایمن (GRAS) اعلام شده است. با توجه به پتانسیل آلرژی‌زایی لیزوزیم، FDA اعلام کرده است که برچسب “لیزوزیم سفیده تخم‌مرغ” برای غذاهای حاوی لیزوزیم اجباری است. علاوه بر این، مصرف مقادیر کم لیزوزیم در پنیر خطری برای سلامت مصرف‌کننده ندارد.

نتیجه‌گیری

لیزوزوم گرفته شده از تخم‌مرغ به دلیل در دسترس و همینطور مقرون به صرفه‌تر بودن، یک منبع صنعتی اصلی برای کاربردهای عملی محسوب می‌شود. همه لیزوزوم‌ها با هیدرولیز پیوندهای (4-1) بتاگلیکوزیدی بین N-استیل‌مورامیک(NAM) و N-استیل‌گلوکزامین (NAG) زنجیره‌های پپتیدوگلیکان، فعالیت ضدمیکروبی دارند و این فعالیت تحت تاثیر فاکتورهای مختلفی مثل قدرت یونی، pH، فعالیت آبی، وجود مهارکننده‌های لیزوزیم، محتوای نمک، دما و وجود مواد شیمیایی تقویت‌کننده می‌باشد.

روش‌های فیزیکی و شیمیایی متفاوتی برای بهبود حساسیت باکتری‌های گرم منفی در برابر لیزوزیم به کار برده شد. این آنزیم به عنوان یک نگهدارنده طبیعی در شیر پستانداران وجود دارد، در نتیجه برای محصولات لبنی از جمله پنیر قابل استفاده است و با توجه به مطالعات، لیزوزیم در تولید پنیر به صورت مستقیم یا در آب نمک، می‌تواند در جهت مهار رشد باکتری‌های عامل فساد و بهبود بافت، بادکردگی، ایجاد طعم و مزه نامطلوب استفاده شود. از آنزیم لیزوزیم می‌توان در بسته‌بندی‌ها مانند فیلم و پوشش‌ها برای حفظ عملکرد و فعالیت ضد میکروبی خود در دوره‌ی نگهداری و  دوره رسیدن در جهت جلوگیری از آلودگی‌های پس از فرآیند (ثانویه) استفاده شود.

در آخر می‌توان بیان کرد که لیزوزیم به عنوان یک ماده جایگزین می‌تواند به تنهایی یا به عنوان بخشی از فناوری برای بهبود محصولات غذایی از جمله پنیر بکار رود. همچنین پیشنهاد می‌شود که استفاده‌ از لیزوزیم در ترکیب با سایر آنزیم‌های ضد میکروبی و فناوری‌های جدید، مانند پلاسمای سرد، میدان الکتریکی پالسی با شدت بالا، و تابش برای افزایش کارایی ضد میکروبی آن در تولید پنیر، در تحقیقات آینده مورد بررسی قرار بگیرد.

منبع:

Khorshidian N, Khanniri E, Koushki MR, Sohrabvandi S, Yousefi M. An overview of antimicrobial activity of lysozyme and its functionality in cheese. Frontiers in nutrition. 2022 Mar 9; 9:833618. DOI: https://doi.org/10.3389/fnut.2022.833618