در مقاله قبل، به مواردی همچون طبقه‌بندی اگزوپلی‌ساکارید (EPS)، کاربرد آن‌ها در صنایع غذایی و تاثیر آن‌ها بر سلامتی اشاره شد. در این مبحث به عوامل موثر بر سنتز اگزوپلی‌ساکاریدها توسط باکتری‌های اسید لاکتیک می‌پردازیم.

گونه‌های مختلف باکتری‌های اسیدلاکتیک تحت تاثیر عوامل مختلف، قادر به تولید اگزوپلی‌ساکارید هستند. به عنوان مثال استرپتوکوکوس ترموفیلوس قادر به سنتز ۰.۱ گرم در لیترEPS  بوده، در حالی‌که لاکتوباسیلوس‌ها مانند لاکتوباسیلوس پلانتاروم، لاکتوباسیلوس فرمنتوم، و لاکتوباسیلوس بولگاریکوس به ترتیب به میزان ۰.۱۴، ۰.۷۵، و ۰.۰۶-۰.۱۵ گرم در لیتر از این ماده تولید می‌کنند.

در حال حاضر بیشترین میزان تولید اگزوپلی‌ساکارید متعلق به زیرگونه‌های خاصی از لاکتوباسیلوس کفیرانوفاسینس (۲.۵ گرم در لیتر)، لاکتوباسیلوس پلانتاروم (۲.۸گرم در لیتر)، و لاکتوباسیلوس رامنوسوس (۲.۸ گرم در لیتر) است.

علاوه بر گونه باکتری عوامل مختلف دیگری در سنتز اگزوپلی‌ساکارید نقش دارند که می‌توان به ترکیب محیط کشت، مانند منابع نیتروژن و کربن، دما، اسیدیته محیط کشت، زمان تخمیر، مرحله رشد باکتری‌، و همچنین میکروفلور کمکی اشاره کرد.

۱. ترکیب محیط کشت

تأثیر ترکیب محیط کشت بر میزان EPS تولید شده توسط LAB گزارش شده است. شرایط رشد باکتری‌ها یا به‌عبارتی ترکیب محیط کشت که شامل نوع کربن و نیتروژن است، تاثیر زیادی در تولید اگزوپلی‌ساکارید دارد، اما ترکیب مونوساکاریدها که واحدهای سازنده EPS هستند لزوما به منبع کربن باکتری‌ها، وابسته نیست. مساله مهم این است که از نظر کاربردی، یک سویه LAB در شرایط مختلف رشد، ممکن است EPSهای مختلفی تولید کند. 

منابع کربن:

با بررسی نتایج به‌دست آمده از باکتری‌های مختلف در محیط‌های کشت متنوع، می‌توان به درک بهتر این مطلب رسید:
-    لاکتوباسیلوس بولگاریکوس و لاکتوباسیلوس کازئی در دو محیط کشت که یکی براث M17 (غنی از نیتروژن و کربن) و دیگری شیر ساده است، مقادیر متفاوتی از اگزوپلی‌ساکارید را تولید می‌کنند. در این مثال، میزان تولید در محیط براث M17 بیش از دو برابر محیط ساده شیر است، در صورتی‌که میزان اگزوپلی‌ساکارید تولید شده توسط استرپتوکوکوس ترموفیلوس کاملا برعکس است و شیر محیط مناسب‌تری برای آن محسوب می‌شود. 
-    میزان کفیران که توسط دسته‌ای از باکتری‌های مربوطه تولید می‌شود، تحت تاثیر دی‌ساکاریدها که منبع کربن است، نیز متفاوت است به گونه‌ای که در محیط غنی از لاکتوز، ۴.۳٪ و در محیط حاوی ساکاروز این میزان به ۳.۸٪ رسید، اما در محیط‌های حاوی فروکتوز و گلوکز این میزان کمتر بود.
-    میزان اگزوپلی‌ساکارید تولید شده توسط لاکتوباسیلوس فرمنتوم در محیط حاوی گلوکز نسبت به فروکتوز، لاکتوز و گالاکتوز در بیشترین حالت خود بوده است.
-    زیرگونه خاصی از استرپتوکوکوس ترموفیلوس که از ماست خانگی بلغاری جداسازی شده بود، در محیط حاوی ساکارز، نسبت به محیط حاوی لاکتوز، اگزوپلی‌ساکارید بیشتری تولید کرد.
با توجه به این مثال‌ها می‌توان متوجه شد که با اصلاح منابع کربن در شیر، می‌توان آن را به محیطی مناسب برای تولید ترکیبات اگزوپلی‌ساکارید تبدیل کرد.

منابع نیتروژن:

یکی دیگر از ترکیبات موثر جهت تولید اگزوپلی‌ساکاریدها در محیط کشت، منبع نیتروژن است. مثلا میزان تولید کفیران تا حد زیادی بستگی به منبع نیتروژن دارد. تحقیقات نشان داده است که وجود نیتروژن آلی در محیط کشت، به طور قابل توجهی تولید EPS خاص مانند کفیران را بهبود می‌بخشد. این میزان بیشتر از زمانی است که محیط کشت حاوی نیتروژن معدنی باشد. به‌علاوه با تنوع نیتروژن (آلی و معدنی) باز هم میزان متفاوتی کفیران تولید می‌شود. به عنوان مثال محیط کشت حاوی کازئین که نوعی نیتروژن آلی است منجر به تولید بیشترین کفیران نسبت به پپتون، تریپتوفان، و عصاره مخمر می‌شود. از طرفی در محیط‌های حاوی کلریدآمونیوم و سولفات آمونیوم که نیتروژن معدنی هستند، باز هم از این میزان کمتر است.

۲. پارامترهای فیزیکوشیمیایی

پارامترهای فیزیکوشیمیایی نیز علاوه بر رشد باکتری بر تولید EPS توسطLAB  تاثیر می‌گذارد.

دما

دما تاثیر زیادی در تولید اگزوپلی‌ساکاریدها توسط باکتری‌های اسید لاکتیک دارد. براساس تحقیقات صورت گرفته، بیشترین میزان تولید EPS در دمای کمتر از دمای بهینه رشد هر سویه (C۱۸-۲۵ برای گونه‌های مزوفیل، و  C۳۵-۳۷ برای گونه‌های ترموفیل) اتفاق می‌افتد، چرا که کاهش دما منجر به استرس فیزیولوژیکی سلول باکتری می‌شود. مخصوصا این شرایط در مورد گونه‌هایی مانند استرپتوکوکوس ترموفیلوس که در فعالیت پروتئولیتیکی دچار نقص هستند، بسیار مشهود است.

در آزمایشی تاثیر دما بر روی استرپتوکوکوس ترموفیلوس مورد بررسی قرار گرفت. با توجه به این که دمای بهینه رشد این باکتری C۴۲ است، برای اثبات این موضوع، دمای C۳۷ انتخاب گردید. بدون در نظر گرفتن ترکیب محیط کشت، در کمتر از دمای بهینه برای رشد، تولید اگزوپلی‌ساکارید ۵ برابر افزایش یافت. این بدین معنی است که حتی در شیر بدون چربی، در دمای C۳۷، میزان تولید EPS پنج برابر بیشتر از دمای C۴۲ می‌باشد. در زیر به مثال‌های دیگری آورده شده است:

-    باکتری لاکتوباسیلوس بولگاریکوس با دمای بهینه رشد C۴۰، در C۳۰-۴۰ میزان بیشتری اگزوپلی‌ساکارید را تولید می‌کند. همچنین تولید EPS در دمای C۴۵ تقریباً به نصف کاهش یافت.
-    در سنتز کفیران، با وجود اینکه دمای بهینه برای رشد دانه‌های کفیران، C۳۷ است، اما کمترین میزان تولید اگزوپلی‌ساکارید در همین دما و بیشترین میزان آن در C۲۵ است.
-    از طرفی گزارشاتی مبنی بر این بوده که در دمای بهینه رشد (C۳۷) سویه‌هایی از لاکتوباسیلوس فرمنتوم و لاکتوباسیلوس کازئی، بیشترین میزان اگزوپلی‌ساکارید را تولید می‌کنند.
-    با انجام آزمایش بر روی لاکتوکوکوس لاکتیس کرموریس مشخص شد دما تاثیری بر تولید اگزوپلی‌ساکارید ندارد. 

زمان تخمیر

مدت زمان انکوباسیون بر سنتز اگزوپلی‌ساکارید توسط باکتری‌های اسید لاکتیک نقش مهمی را ایفا می‌کند. با بررسی نمودار رشد لاکتوباسیلوس فرمنتوم مشخص شد در مرحله ثابت رشد، پس از ۳۲ ساعت، با تولید گلیکوهیدرولاز که کاتالیزوری جهت تخریب پلی‌ساکاریدها است، میزان اگزوپلی‌ساکاریدها کاهش می‌یابد و البته کاهش این ترکیبات پس از انکوباسیون طولانی مدت، در سایر سویه‌ها نیز مشابه است. نکته قابل توجه این است که در دما و pH پایین‌تر از بهینه رشد هر باکتری، میزان تخریب و در نهایت کاهش اگزوپلی‌ساکارید، کمتر است.

اسیدیته

در مورد برخی باکتری‌ها مانند استرپتوکوکوس ترموفیلوس به دلیل اینکه بیشترین میزان اگزوپلی‌ساکاریدها در پایان تخمیر انجام می‌شود، محتوای EPS در طول تخمیر تغییری نمی‌کند. در کل همان‌طور که می‌دانیم pH بهینه در بین گونه‌ها و سویه‌های باکتری‌های اسیدلاکتیک متفاوت است،  اما به طور میانگین حدود ۶ می‌باشد. به عنوان مثال بیشترین میزان رشد باکتری و تولید اگزوپلی‌ساکارید توسط استرپتوکوکوس ترموفیلوس، در pH ۶.۲ و در مورد باکتری لاکتوباسیلوس بولگاریکوس، ۶.۵ است. اما در مورد باکتری لاکتوباسیلوس فرمنتوم، با وجود اینکه pH رشد باکتری حدود ۷ است، اما در pH کمی پایین‌تر یعنی ۶.۵، بیشترین تولیدEPS  رخ می‌دهد. همچنین در برخی از گزارشات مطرح شد که pH پایین (۴.۹) به طور قابل توجهی بر تخریب اگزوپلی‌ساکارید تأثیر گذاشته و منجر به کاهش بازده تولید آن می‌شود.

۳. فاکتورهای باکتریایی

سویه و گونه باکتری تولیدکننده EPS

همانطور که گفته شد، وجود گونه‌ها/ سویه‌های مختلف باکتری بر تولید اگزوپلی‌ساکارید تاثیر می‌گذارند. این رفتار متفاوت سویه‌ها از نظر تولید EPS توسط مطالعات تایید شده است. نشان داده شده است که تولید EPS توسط سویه‌های مختلف ویسلا سیبریا در محیط کشت MRS براث دارای پراکندگی حدود ۲.۸ برابر است. بعلاوه، مقادیر اگزوپلی‌ساکارید تولیدشده توسط سویه‌های مختلف لاکتوباسیلوس پلانتاروم جدا شده از منابع مختلف، متفاوت بود. در مطالعه دیگری سویه‌های مختلف لوکونوستوک مزنتروئیدس اگزوپلی‌ساکارید با غلظت های متفاوتی تولید کردند. 

این رفتار متفاوت LAB از نظر تولید اگزوپلی‌ساکارید را می‌توان از طریق تغییرات در بیان ژن در پاسخ به شرایط استرس توضیح داد. به عنوان مثال، بیان ژن کدکننده گلیکوزیل ترانسفراز مربوط به سنتز EPS پس از قرار گرفتن در معرض استرس مربوط به شرایط اسیدی، نمک‌های صفراوی، و اسمزی در بیفیدوباکتریوم انیمالیس زیرگونه لاکتیس افزایش یافت. مطالعات دیگری این بیان بیش از حد ژن‌های مربوط به تولید اگزوپلی‌ساکارید در هنگام مواجهه با شرایط استرس‌زا را در گونه‌های دیگر مانند استرپتوکوکوس ترموفیلوس و لاکتوباسیلوس پاراکازئی نشان داده است.

حضور سایر باکتری‌ها در مخلوط استارتر کالچر

فعالیت باکتری‌های مولد اگزوپلی‌ساکارید نیز می‌تواند تحت تأثیر حضور همزمان سویه‌های LAB مختلف در محیط کشت قرار گیرد. این موضوع از اهمیت بالایی برخوردار است، زیرا همانطور که می‌دانیم در تولید استارترهای صنعتی، معمولاً از کشت‌های مخلوط متشکل از سویه‌های متعدد گونه‌های LAB و/یا گونه‌های مختلف استفاده می‌شود. گونه‌های مختلف که در تولید اگزوپلی‌ساکاریدها موثر هستند می‌توانند با تولید متابولیت‌هایی مانند باکتریوسین‌ها اثر بازدارندگی روی هم داشته و تولید اگزوپلی‌ساکارید را با اختلال مواجه کنند، و یا اینکه مانند باکتری‌های ماست (لاکتوباسیلوس بولگاریکوس و استرپتوکوکوس ترموفیلوس) با همکاری هر دو گونه تولید این ترکیبات تشدید شود.

در برخی از محصولات نیز که از مخلوط سویه‌های تولیدکننده اگزوپلی‌ساکارید و سویه‌های غیرتولیدکننده اگزوپلی‌ساکارید تشکیل شده است، به طور غیرمستقیم، نوع اگزوپلی‌ساکارید تشکیل شده به شکلی است که می‌تواند منجر به تغییرات مطلوب در محصول نهایی شود.

نتیجه

توانایی تولید EPS توسط LAB به عوامل مختلفی بستگی دارد و میزان تولید تا حد زیادی به گونه و سویه خاص بستگی دارد. پارامترهای فیزیکوشیمیایی موثر بر رشد باکتری‌ها (مانند دما، زمان انکوباسیون، pH، میزان اکسیژن و غیره) و همچنین منابع مختلف کربن و نیتروژن عوامل اصلی موثر بر سنتز اگزوپلی‌ساکارید هستند. علاوه بر این، یک سویه LAB تحت شرایط مختلف رشد قادر به سنتز اگزوپلی‌ساکاریدهای متفاوتی است. ترکیب محیط کشت، از جمله مواد مغذی، یکی از مهم‌ترین عوامل موثر بر تولید EPS است.

منابع:

Prete, Roberta, Mohammad Khairul Alam, Giorgia Perpetuini, Carlo Perla, Paola Pittia, and Aldo Corsett. "Lactic Acid Bacteria Exopolysaccharides Producers: A Sustainable Tool for Functional Foods". Foods. 2021. DOI: 10.3390/foods10071653.
Berthold-Pluta A., Pluta A., Garbowska M., and Stasiak-Różańska L. Exopolysaccharide-Producing Lactic Acid Bacteria – Health-Promoting Properties And Application In The Dairy Industry. Advancements of Microbiology. 2019. DOI: https://doi.org/10.21307/PM-2019.58.2.191