سه معیار مهم در تولید ماست پروبیوتیک وجود دارد که می‌تواند ارزش افزوده محصول نهایی را تحت تاثیر قرار دهد: 
1.    کاهش زنده‌مانی باکتری‌های پروبیوتیک در طول فرآیند تولید و نگهداری
2.     زمان نسبتاً بالاتر انکوباسیون مورد نیاز در مقایسه با ماست معمولی
3.    صفات ارگانولپتیک غیرقابل قبول ماست نهایی

نکته مهم این است که ماست‌های حاوی پروبیوتیک باید تا زمان مصرف بالاتر از  CFU 106 پروبیوتیک زنده در هر وعده داشته باشند. با این حال، باکتری‌های پروبیوتیک موجود در ماست پس از گذر از شرایط سخت گوارشی، زنده‌مانی کافی ندارند. عوامل متعددی در تعیین بقای پروبیوتیک‌ها در لبنیات تخمیری موثر است.

1. سویه استارترکالچر و پروبیوتیک

نوع سویه‌های مختلف میزان تاثیر فاکتورهای دخیل بر زنده‌مانی پروبیوتیک در ماست را تعیین می‌کند، درواقع گونه‌های مختلف با قرار گرفتن در شرایط مختلف، تحمل‌پذیری کاملاً متفاوتی دارند. لاکتوباسیل‌ها به استثنای چند مورد نسبت به بیفیدوباکتری‌ها در برابر اسید و اکسیژن مقاومت بیشتری دارند. سطح pH کمتر از 4.6 برای گونه‌های بیفیدوباکتری مضر است. گزارش شده است که گونه‌های مقاوم به اکسیژن دارای مقادیر بالای اکسیدوردوکتاز برای حذف اکسیژن از محیط سلولی هستند. برخلاف بیفیدوباکتری‌ها، پراکسید هیدروژن تاثیر حداکثری بر اسیدوفیلوس دارد. بنابراین، در ترکیب با لاکتوباسیلوس بولگاریکوس به عنوان مولد پراکسید هیدروژن، اسیدوفیلوس در مقایسه با بیفیدوباکتر زنده‌مانی کمتری دارد. 

زمان نگهداری

زمان‌ نگهداری مناسب نیز به سویه پروبیوتیک بستگی دارد. طبق مطالعات بیشترین میزان زنده‌مانی اسیدوفیلوس و لاکتیس در طی 20 روز نگهداری به ترتیب در دمای 2 و C°8 است. باید توجه داشت که به دلیل توسعه اسید مقبولیت کلی ماست پروبیوتیک با افزایش زمان نگهداری کاهش می‌یابد. علاوه براین، استفاده از ترکیب چند سویه‌ پروبیوتیک در مقایسه با یک سویه باعث کاهش رشد و بقا در طی نگهداری می‌شود، که احتمالاً به دلیل فعالیت‌های آنتاگونیستی است. 

علاوه بر این، به دلیل تولید اسیداستیک و اسیدلاکتیک توسط پروبیوتیک‌ها در شرایط بهینه تخمیر و همچنین تولید ترکیبات متابولیکی مختلف توسط LAB، خواص ارگانولپتیک تغییر می‌یابد. بنابراین رشد مازاد پروبیوتیک‌ها باعث ایجاد ایجاد عطر و طعم نهایی اسیدی می‌شود. سطح تلقیح سویه‌های پروبیوتیک نیز می‌تواند بر زنده‌مانی آ‌‌ن‌ها در طی تخمیر و ذخیره‌سازی تأثیر بگذارد. بدیهی است که استفاده از میزان کافی پروبیوتیک در تلقیح اولیه می‌تواند اثر درمانی موردانتظار را در زمان مصرف تضمین کند، و تلقیح بیش از حد با کاهش زنده‌مانی و تغییر طعم همراه است.

تعامل بین استارترکالچرها و پروبیوتیک 

فعالیت استارترکالچرهای ماست گاهی بقای باکتری‌های پروبیوتیک را تهدید می‌کند. بنابراین، تعامل بین استارترکالچرها (ترموفیلوس و لاکتوباسیلوس بولگاریکوس) و باکتری‌های پروبیوتیک به عنوان یک جنبه مهم در تولید ماست پروبیوتیک در نظر گرفته می‌شود. توسعه اسید، برای مثال تولید اسیدلاکتیک در طی تخمیر و ذخیره‌سازی، و تولید پراکسید هیدروژن توسط لاکتوباسیلوس بولگاریکوس می‌تواند بر باکتری‌های پروبیوتیک تأثیر منفی بگذارد. با توجه به این که دمای انکوباسیون بالا (C°44) در طول تخمیر باعث افزایش رشد بولگاریکوس می‌شود، بنابراین، نرخ بالای توسعه اسیدلاکتیک و پراکسید هیدروژن توسط بولگاریکوس می‌تواند باعث کاهش زنده‌مانی پروبیوتیک‌ها شود. اسیدوفیلوس به دلیل نداشتن کاتالاز قادر به هیدرولیز H2O2 نیست، بنابراین H2O2 قوی‌ترین عامل کاهش بقا و رشد پروبیوتیک‌ها محسوب می‌شود. 

به این ترتیب، انکوباسیون در دمای C°37، علاوه بر اینکه دمای رشد بهینه باکتری‌های پروبیوتیک است، به دلیل کاهش رشد بولگاریکوس تأثیر مثبتی بر تعامل بین پروبیوتیک‌ها و بولگاریکوس دارد. این اثر تعاملی ممکن است به تجزیه جزئی پروتئین کازئین به پپتید و اسیدهای آمینه آزاد توسط بولگاریکوس که مصرف پروتئین‌های شیر را توسط پروبیوتیک‌ها تسهیل می‌کند نسبت داده شود. با این وجود، ترموفیلوس به دلیل توانایی در مصرف اکسیژن ممکن است از رشد سویه‌های پروبیوتیک، عمدتاً بیفیدوباکتری‌ها، حمایت کند.

2. اسیدیته و pH قابل تیتراسیون

pH و اسیدیته قابل تیتراسیون به شدت بر قابلیت زنده‌مانی و ویژگی‌های متابولیک باکتری‌های پروبیوتیک تأثیر می‌گذارد. pH بهینه رشد بیفیدوباکتری و لاکتوباسیلوس به ترتیب بین 7-6 و 09/6-5/5 متغیر است. لاکتوباسیلوس‌ها قادر به رشد در محصولات تخمیری باpH  بین 7/3 و 3/4 نیز هستند. گونه‌های بیفیدوباکتر تحمل اسید کمتری دارند وpH  پایین‌تر از 6/4 برای بقای آ‌‌ن‌ها کشنده است. 

تولید اسید توسط استارترکالچرها دلیل اصلی کاهش زنده‌مانی پروبیوتیک‌ها در ماست است که به تحمل سویه دربرابر اسید مربوط می‌شود. به عنوان مثال، بدیهی است که لاکتوباسیل‌ها به اسید مقاوم‌تر هستند و در ماست با pH 3.7 تا 3/4 زنده می‌مانند. گزارش شده است که با اعمال شوک حرارتی (C°58، 5 دقیقه) می‌توان توسعه اسید توسط LAB را مهار کرد و بنابراین زنده‌مانی باکتری‌های پروبیوتیک را افزایش داد. به طرز جالبی در pH پایین، وجود اسید آلی غیر یونیزه می‌تواند خاصیت باکتری‌کشی اسید را کاهش دهد. همچنین، مقدار اسید آلی اثر بیشتری نسبت به pH بر زنده‌مانی پروبیوتیک دارد. 

3. حضور اکسیژن 

محتوای اکسیژن و پتانسیل اکسیداسیون-احیا از مهم‌ترین عوامل موثر بر پروبیوتیک‌ها در طول دوره نگهداری می‌باشند. اکسیژن مولکولی عامل مهمی در ایجاد واکنش‌های اکسیداتیو و در نتیجه بی‌ثباتی باکتریایی است و اثر مخربی بر رشد و زنده‌مانی پروبیوتیک دارد، زیرا اکثر گونه‌های پروبیوتیک بی‌هوازی اجباری می‌باشند. سطح بالای اکسیژن در بسته‌بندی در طی نگهداری و نفوذ اکسیژن درون محصول سبب کاهش زنده‌مانی لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس و بیفیدوباکتری‌ها در محصولات تخمیری می‌گردد. علاوه بر این، فرآیندهای پردازش در تولید ماست، مانند مراحل هم زدن و مخلوط کردن، علاوه بر انتشار اکسیژن در طول ذخیره‌سازی، سطوح بالایی از اکسیژن را به محصول نهایی وارد می‌کند.

در واقع اکسیژن در سه مرحله بر روی پروبیوتیک‌ها اثر دارد: 

اثر مستقیم بر روی برخی از سلول‌ها، تولید پراکساید سمی در حضور اکسیژن توسط برخی از استارترها، و تولید رادیکال‌های آزاد از اکسیداسیون برخی از ترکیبات مانند چربی‌ها. درجه حساسیت اکسیژن در بین گونه‌ها و زیرگونه‌های پروبیوتیک متفاوت است. بیفیدوباکتری‌ها نسبت به لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس به دلیل طبیعت غیرهوازی خود، حساسیت بیشتری به اکسیژن دارند.

راه‌حل

اتخاذ روش‌هایی برای کاهش سطح اکسیژن، در حفظ باکتری‌های پروبیوتیک بسیار موثر است، مانند بسته‌بندی تحت خلاء، استفاده از مواد بسته‌بندی با قابلیت پایین نفوذ اکسیژن، افزودن جاذب‌های اکسیژن، و کنترل فرآیند تولید به گونه‌ای که حداقل اکسیژن محلول به محصول وارد گردد. همچنین، عوامل دیگری مانند ضخامت ماده بسته‌بندی، نفوذ نور و تکنیک‌های بسته‌بندی می‌تواند بر بقای پروبیوتیک‌ها اثر بگذارد. گزینه‌های دیگری شامل افزودن مواد شیمیایی، آنتی‌اکسیدان‌ها، و استفاده از لاکتوکوکوس لاکتیس به منظور پاک‌سازی اکسیژن محیط، یا درمان‌های آنزیمی (مانند گلوکز اکسیداز) می‌تواند به زنده‌مانی پروبیوتیک‌ها کمک کند. 

بسته‌بندی شیشه‌ای با نفوذپذیری کم اکسیژن نیز می‌تواند به بقای پروبیوتیک‌ها کمک کند. با این وجود، بسته‌بندی‌های پلاستیکی مانند پلی‌اتیلن (PE) در برابر اکسیژن نفوذپذیر است و امکان انتشار اکسیژن را در طول ذخیره‌سازی فراهم می‌کند. استفاده از فیلم‌های پلاستیکی با خصوصیت بازدارندگی اکسیژن و بسته‌بندی‌ فعال همراه با جاذب‌های اکسیژن، بسته‌بندی شیشه‌ای، استفاده از مواد پلیمری لامینه شده با قابلیت بازدارندگی بالای اکسیژن همراه با فیلم‌های جاذب اکسیژن در بسیاری از مطالعات پیشنهاد شده است. با این حال با توجه به هزینه بالا و خطرات حمل و نقل این گونه بسته‌بندی‌ها، تولیدکنندگان ترجیح می‌دهند از بسته‌بندی پلاستیکی استفاده کنند، پس روش‌های جایگزینی مانند بسته‌بندی خلاء، استفاده از جاذب‌های اکسیژن، و بسته‌بندی‌های فعال با مواد بازدارنده اکسیژن می‌تواند بصورت بالقوه برای بسته‌بندی محصولات پروبیوتیک به کار گرفته شود.

4. دما و زمان تخمیر و نگهداری

تخمیر

دمای تخمیر از مهم‌ترین فاکتورهای موثر بر بقای پروبیوتیک‌ها و همچنین ویژگی‌های حسی ماست پروبیوتیک می‌باشد. دمای بهینه رشد بیشتر باکتری‌های پروبیوتیک بین C°43-37 متفاوت است، به استثنای برخی گونه‌ها مانند لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس که می‌توانند در دماهای بالاتر (C°42-40) رشد کنند. علاوه بر این، سطوح بقای پروبیوتیک در طی تخمیر در دمای C°40 بالاتر از دمای C°44 است که احتمالاً به دلیل میزان بالاتر تولید اسید استیک توسط گونه‌های بیفیدوباکتری و اثر آنتاگونیست باکتری استارتر ماست است. بدیهی است که دمای بالاتر از C°45 در برخی از مراحل فرآوری اثرات منفی بر رشد و زنده‌مانی پروبیوتیک دارد. بنابراین، برای حفظ تعداد پروبیوتیک‌ها، مدت زمان کمتری از تخمیر در دماهای بالاتر مورد نیاز است.

به منظور زنده‌مانی بیشتر پیشنهاد می‌شود که پروبیوتیک‌ها در انتهای پاستوریزاسیون اضافه گردند. به دلیل کاهش بقای این باکتری‌ها در حضور اکسیژن، انجام تخمیر تحت خلاء یکی از مهم‌ترین روش‌های کاهش محتوای اکسیژن حین تخمیر می‌باشد. استفاده از شوک حرارتی غیرکشنده به باکتری‌ها باعث افزایش تحمل فشار حرارتی ثانویه و همچنین افزایش مقاومت حرارتی لاکتوکوکسی و لاکتوباسیل‌ها تا ۳۰۰ برابر می‌شود.

نگهداری

دمای بهینه نگهداری°C 4-5 برای پروبیوتیک و برای پروبیوتیک‌های فریز شده °C18- تعریف شده است. باکتری‌های استارتر (LABs) و پروبیوتیک در طول دوره تخمیر رشد می‌کنند، اما تعداد آ‌‌ن‌ها در طول نگهداری در یخچال کاهش می‌یابد. بیشترین میزان بقای لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس در دوره نگهداری بیش از 20 روزه زمانی بدست می‌آید که در دمایC °۲ نگهداری شود، در حالیکه در مورد بیفیدوباکتریوم لاکتیس به دلیل حساسیت بالاتر، C°8 دمای بهینه است. 

بنابراین، فرآیند تخمیر در دمای 37 و C°44 به مدت تقریباً 6 ساعت به ترتیب برای دستیابی به بالاترین و کمترین میزان بقای پروبیوتیک مورد نیاز است. در دمای یخچال (5 یا C°8)، بولگاریکوس سریع‌تر از C°2 رشد می‌کند، و بنابراین متابولیت‌هایی مانند پراکسید هیدروژن و اسیدلاکتیک تولید می‌شوند که برای بقای پروبیوتیک‌ها کشنده است. به طور کلی، دمای ذخیره‌سازی بالاتر باعث افزایش فعالیت‌های متابولیکی LAB  می‌شود که میزان مرگ آ‌‌ن‌ها را افزایش می‌دهد. بدیهی است که نگهداری ماست در دمای پایین‌تر (C°2) به دلیل تولید کمتر متابولیت‌های مضر با مدت زمان نگهداری طولانی‌تر ماست پروبیوتیک مرتبط است.

5. سایر شرایط فرآیند

عملیات حرارتی

عملیات حرارتی (زمان و دما) شیر در طول تولید ماست نقشی جزئی در زنده‌مانی پروبیوتیک ایفا می کند. براساس مطالعات بالاترین میزان پروبیوتیک‌ زنده (اسیدوفیلوس و بیفیدوباکتری) طی عملیات حرارتی شیر در C°95/ 15 دقیقه در مقایسه با C°85/ 30 دقیقه می‌باشد. این موضوع را می‌توان از طریق حذف باکتری‌های رقابتی در شیر و همچنین افزایش ارزش غذایی شیر به دلیل تخلیه اسیدهای آمینه آزاد و پپتیدهای موجود توضیح داد. 

هموژنیزاسیون 

هموژنیزاسیون یکی دیگر از پارامترهایی است که بر تعداد زنده پروبیوتیک‌ها در ماست تأثیر می‌گذارد. بنابر گزارش‌ها، افزایش فشار، دما، و تعداد مراحل دخیل در این فرآیند به دلیل غیرفعال شدن باکتریوفاژهای مضر پروبیوتیک، ممکن است باعث افزایش زنده‌مانی پروبیوتیک‌ها در طول نگهداری محصول شود. علاوه بر این، فشار بالا می‌تواند اسید آمینه آزاد و پپتیدهای کوچک مورد نیاز بیشتری برای رشد و بقای پروبیوتیک را در طول نگهداری محصول تولید کند. هموژنیزاسیون دو مرحله‌ای ممکن است پروتئین‌ها و گلبول‌های چربی را به ترکیبات نسبتاً کوچکی که در دسترس باکتری‌های پروبیوتیک است، بشکند. دمای بالاتر همچنین می‌تواند سیستئین را آزاد، اکسیژن را حذف، و ترکیبات گوگردی ایجاد کند که همه این‌ها ممکن است باعث افزایش بقای پروبیوتیک در ماست شود.

6. مواد تشکیل دهنده ماست

مواد افزودنی و مواد تشکیل دهنده ماست می‌توانند اثر محافظتی، خنثی‌کننده، و یا کشنده بر زنده‌مانی پروبیوتیک‌ها داشته باشند. مواد افزودنی شامل قندها، شیرین‌کننده‌ها، نمک‌ها، ترکیبات عطر و طعم (دی استیل، استالدئید و استوئین)، مواد رنگی، نایسین، ناتامایسین، لیزوزیم، و نیتریت می‌باشد. این ترکیبات بر روی رشد و زنده‌مانی باکتری‌های پروبیوتیک اثر می‌گذارد و دوز بالاتر آن‌ها می‌تواند از رشد باکتری‌های پروبیوتیک در طول نگهداری جلوگیری کند.

افزایش رشد پروبیوتیک‌ها در ماست

باکتری‌های پروبیوتیک در شیر رشد ضعیفی دارند. با این حال، موادی مانند ویتامین‌ها، قند، کازئین، آنتی‌اکسیدان، ترانس گلوتامیناز، مواد معدنی، اسیدهای آمینه (مانند ال‌سیستئین)، غلات، سبزیجات، میوه‌ها، کنسانتره پروتئین آب پنیر (WPC) و عصاره مخمر، با تامین فاکتورهای غذایی ضروری و شرایط مناسب (pH، پتانسیل احیا) سرعت رشد آ‌‌ن‌ها را بهبود می‌بخشد. همچنین استفاده از میوه در ماست همزده به دلیل دریافت مواد مغذی و کاهش تعداد بولگاریکوس می‌تواند بقای اسیدوفیلوس را در مقایسه با ماست ساده بهبود بخشد. همچنین ترکیبات ذکر شده باعث بهبود کیفیت ماست پروبیوتیک از جمله بافت و کاهش سینرزیس بدون اثر قابل توجهی بر خواص حسی می‌شود. 

پری‌بیوتیک

برخی از پری‌بیوتیک‌ها شامل فروکتو- و گالاکتواولیگوساکاریدها اثر مثبتی بر زنده‌مانی باکتری‌های پروبیوتیک به ویژه بیفیدوباکتری‌ها در طی دوره نگهداری دارد. مطالعات نشان داد که مواد طعم‌دهنده مانند توت فرنگی، هلو، موز، و وانیل تأثیر منفی بر بقای پروبیوتیک‌ها در ماست ندارد. البته شایان ذکر است که استفاده از برخی آب میوه‌ها به دلیل اسیدیته بالا یا وجود ترکیبات ضدمیکروبی ممکن است بر بقای برخی پروبیوتیک‌ها تأثیر نامطلوبی بگذارد. برخی از این مواد به عنوان ترکیبات پری‌بیوتیک در نظر گرفته می‌شوند و می‌توانند با تشدید رشد پروبیوتیک‌ها و محافظت از آ‌‌ن‌ها در برابر عوامل مضر، زنده‌مانی آن‌ها را افزایش دهند. 

محتوای چربی

محتوای چربی ماست از دیگر عوامل مهم موثر بر زنده‌مانی پروبیوتیک است. ماست پرچرب به عنوان یک ماتریکس مهارکننده برای رشد گونه‌های بیفیدوباکتر عمل می‌کند، و این امر توسعه اسید در طول نگهداری محصول را افزایش می‌دهد. بنابراین، ترکیب شیر مورد استفاده در تولید ماست می‌تواند زنده‌مانی پروبیوتیک را تعیین کند. 

نتیجه

ماست پروبیوتیک یک غذای فراسودمند محبوب در سراسر جهان است. مزایای سلامتی متعددی از جمله پیشگیری از عفونت دستگاه تنفسی و دستگاه گوارش، کاهش کلسترول خون، کاهش سرعت پیشرفت HIV، بهبود متابولیسم گلوکز، و کنترل دیابت نوع 2 و چاقی به مصرف منظم ماست پروبیوتیک نسبت داده می‌شود. حفظ قابلیت زنده‌مانی باکتری‌های پروبیوتیک در محصول و در طول فرایند و نگهداری مواد غذایی نیاز به نظارت مداوم دارد. عوامل متعددی از جمله pH، اسیدیته قابل تیتراسیون، اکسیژن، شرایط فرآوری (مانند عملیات حرارتی، فرآیند هموژنیزاسیون، و تخمیر)، استارترکالچر (باکتری‌های ماست و نوع پروبیوتیک)، و مواد مختلف مورد استفاده در تولید ماست (مانند پروتئین آب پنیر، WPC، آنتی‌اکسیدان‌ها و میوه‌ها) بر میزان بقای باکتری‌های پروبیوتیک تأثیر می‌گذارند.

منبع:

Mollakhalili Meybodi N, Mohammad Mortazavian A, Arab M, Nematollahi A. Probiotic viability in yogurt: A review of influential factors. International Dairy Journal. 2020. doi: 10.1016/j.idairyj.2020.104793.